冷冻制样问题集锦

Somnus8805

1.  图示中这样的grid改向什么方向优化啊，试了几种不同的glow时间，blot时间，样品load量，最后结果都差别不大。       样品为：膜蛋白，处于detergent里，用vitrobot冻的。

   出现原因：冰太薄，有detergent ， blot的时候溶液跑得太快了，一下子就blot干了

   解决方法：1. 提高浓度，或者冰厚一些 或者冰的厚度均一点会好 （浓度大了 粘度也大 跑得慢）

                  2. 试试manual plunger吧（by 戴兴红-UCLA）

                  3. 增加蛋白浓度，或改变glow discharge 时间（唐麟 川大神经生物学）

                  4. 把样品滴上铜网后，在vitrobot里停留三十秒再吸水，可以尝试减短blot time，增加drain time【增加drain time会让冰变得更薄，所以drain time和blot time 一起尝试，而且vitrobot里湿度接近100%，drain time更多的是让液膜自适应，drain time是blot后的等待时间】（by 潘锡江-FEI）

                   5. 尝试降低blot time和force  或者试试小孔grid （by 柏林 Van Andel institute）

New idea need to discuss：当液膜只有100nm左右厚度的时候，到底是蒸发快还是吸水快，说不清楚 （by 潘锡江-FEI）

New Question：不是说blot以后最好不要有停留 这样air water interface 蛋白容易unfold？

                        答：有detergent的时候，蛋白很难冒头啊，就看冰层厚度和蛋白性质了。

New Question：drain time高的话可以用到多少啊？

                          答：drain time从0.5s开始尝试，最多不超过2s。但是相应的blot time也要减少。【比如说4ul的样品，我设wait time 30s，blot force 0，blot time 3s，drain time 0.5s，以这个为起始点，修改blot time和drain time，其他两个可以不变。】